-
Το ομοεστιακό μικροσκόπιο αναφέρεται σε ένα είδος ειδικού οπτικού μικροσκοπίου που μπορεί να καταγράψει οπτικές φέτες.
Με το φωτισμό και την παρατήρηση ενός σημείου ορίου περίθλασης, η οπτική τεμαχισμό πραγματοποιείται σε ένα ομοεστιακό σύστημα λέιζερ. Αυτό απαιτεί τα δύο τμήματα δέσμης να έχουν την ίδια εστίαση, έτσι είναι "ομοεστιακά". Σε αντίθεση με τις εικόνες ευρείας πεδίου, οι ομοεστιακές εικόνες δεν έχουν καμία θολότητα. Αυτό είναι ένα πλεονέκτημα από μόνο του, επειδή η βαθιά εικόνα του δείγματος είναι σαφής και πλούσια σε λεπτομέρειες. Ωστόσο, το πιο σημαντικό πλεονέκτημα είναι το τρισδιάστατο δυναμικό απεικόνισης με μικροσκοπικά χαρακτηριστικά. Αφού αποκτηθεί η ακολουθία εικόνων κατά μήκος της z-stack, το 3D αντικείμενο ανακατασκευάζεται και εμφανίζεται από τον υπολογιστή.
- Ομοεστιακός φωτισμός
Ο φωτισμός πηγής φωτός σημείων πραγματοποιείται εστιάζοντας την πηγή φωτός σε ένα μικρό διάφραγμα (οπή) και στη συνέχεια εστιάζοντας το στο δείγμα. Όταν το άνοιγμα είναι αρκετά μικρό, το σημείο φωτισμού περιορίζεται μόνο από περίθλαση, όχι από τις γεωμετρικές παράμετροι της πηγής φωτός και του ανοίγματος. Η συνηθισμένη πηγή φωτός είναι μια μεγάλη πηγή φωτός επιφάνειας, οπότε είναι αδύνατο να την εστιάσετε στο σημείο του ορίου περίθλασης. Επομένως, αν και η μετάδοση είναι πολύ χαμηλή, αυτό το είδος εστιασμένου φωτός φωτισμού εξακολουθεί να είναι πολύ απαραίτητο (για παραδοσιακές πηγές φωτός).
Εικόνα 1: φωτισμός για ομοεστιακή απεικόνιση. Το φως από την πηγή φωτός (LS) επικεντρώνεται στην οπή φωτισμού (PI) και στη συνέχεια εισέρχεται στο δείγμα S ..
Το λέιζερ ως πηγή φωτός έχει πολύ υψηλή περιγραφή (το φως σε ένα καλό λέιζερ είναι "εξαιρετικά παράλληλο"). Ως εκ τούτου, το λέιζερ μπορεί να επικεντρωθεί σε ένα σημείο περιορισμένης διάθλασης μέσω ενός μόνο φακού χωρίς να χρησιμοποιεί μια πύλη. Ως εκ τούτου, τα περισσότερα ομοεστιακά μικροσκόπια δεν έχουν πύργο φωτισμού. Η ποιότητα του φωτός εξαρτάται από την ποιότητα της δέσμης του λέιζερ. Εάν η ποιότητα δεν είναι καλή, μπορείτε επίσης να εισαγάγετε την οπή φωτισμού. Το λέιζερ συνήθως συνδέεται με το ομοεστιακό μικροσκόπιο μέσω οπτικών ινών. Αυτές οι ίδιες οι ίνες λειτουργούν επίσης ως οπές.
Η εστίαση και η υψηλή ενεργειακή πυκνότητα του λέιζερ την καθιστούν μια ιδανική πηγή φωτός για ομοεστιακό μικροσκόπιο. Η συνοχή του λέιζερ δεν αποτελεί απαιτούμενο χαρακτηριστικό της ομοεστιακής απόδοσης. Αντίθετα, είναι μια πρόκληση για τους οπτικούς σχεδιαστές, διότι θα προκαλέσουν ψευδή πρότυπα παρεμβολής, απαιτούνται προσεκτικές στρατηγικές σχεδιασμού.
Επιπλέον, το γεγονός ότι το παραδοσιακό λέιζερ εκπέμπει μόνο ένα μόνο χρώμα (Laser- "Line") έχει τους δικούς του περιορισμούς. Σε απεικόνιση και μέτρηση πολλαπλών φθορισμού, απαιτείται σύνθετη διάταξη πολλαπλών λέιζερ. Το λευκό λέιζερ επιλύει επιδέξια το πρόβλημα της πολύχρωμης απεικόνισης.
Εικόνα 2: Σύγκριση της ομοεστιακής (δεξιάς περιοχής) και της μη κινηματογραφικής απεικόνισης. Στο Feulgen χρωματισμένο με ποντίκι τροφοβλάστες. Πολλές πληροφορίες των μη-κινητικών εικόνων δεν προέρχονται από το εστιακό επίπεδο. Η ομοεστιακή οπτική εξαλείφει όλους τους ασαφείς παράγοντες και καθιστά τη δομή καθαρή.
Ομοεστιακή ανίχνευση
Οι περισσότεροι ανιχνευτές έχουν μια αρκετά μεγάλη ευαίσθητη περιοχή (οι σωλήνες φωτοπολλαπλασιασμού είναι συνήθως αρκετά τετραγωνικά εκατοστά). Η ομοεστιακή οπτική χρειάζονται ανίχνευση σημείων. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να εκτελεστεί ανίχνευση σημείου με την εισαγωγή ενός μικρού ανοίγματος (pinhole) στη δέσμη φωτός. Εστιάζοντας το φως του δείγματος στην οπή, συλλογή και καταγραφή του μεταδιδόμενου φωτός.
Επειδή το πρότυπο διάθλασης εξαρτάται από το αριθμητικό διάφραγμα και το μήκος κύματος, είναι απαραίτητη η ανίχνευση με πύλη. Επομένως, όταν αλλάζουν αυτές οι παράμετροι, το μέγεθος του πέλματος πρέπει να ρυθμιστεί.
Όταν ο αντικειμενικός φακός αλλάζει (συνήθως με την αλλαγή του αριθμητικού ανοίγματος), το σύγχρονο μικροσκόπιο ομοεστιακής σάρωσης θα αλλάξει αυτόματα τη διάμετρος του pinhole. Ως εκ τούτου, οι οπές συνήθως σχεδιάζονται ως διπλά ή πολλαπλά ανοίγματα.
Στην πραγματικότητα, το κατάλληλο μέγεθος της οπής εξαρτάται όχι μόνο από το μήκος κύματος και το αριθμητικό άνοιγμα, αλλά και την εσωτερική μεγέθυνση των οπτικών στοιχείων στο μικροσκόπιο.
Ως εκ τούτου, δεν είναι μόνο ανεπιθύμητο, αλλά και λάθος να συγκρίνουμε άμεσα τις διαμέτρους των πύργων σε μικροσκόπια με διαφορετικά σχέδια. Εάν η διάμετρος του pinhole δεν έχει ρυθμιστεί στη βέλτιστη τιμή, το σύστημα δεν θα είναι σε θέση να εκτελέσει ομαλά την οπτική τεμαχισμό (δηλαδή, να μεταδίδει θόλωση defocus) ή να αποκόψει την ένταση άσκοπα χωρίς να αποκτήσει περαιτέρω οπτική ποιότητα τεμαχισμού (με αποτέλεσμα περιττές εικόνες θορύβου).
Εικόνα 3: Ανίχνευση σε ομοεστιακή απεικόνιση. Το φως από το δείγμα S επικεντρώνεται στην παρατήρηση (PO) και στη συνέχεια στον ανιχνευτή DE.
Οπτική διαδρομή της ομοεστιακής σάρωσης
Η διαδρομή ομοεστιακής δέσμης στο σύστημα ομοεστιακής σάρωσης είναι μόνο ο συνδυασμός φωτισμού σημείων και ανίχνευσης σημείων. Αυτός ο συνδυασμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως οπτικό μαχαίρι. Μόνο φωτόνια από το εστιακό επίπεδο μπορούν να μεταδοθούν στον αισθητήρα. Ενώ όλα τα φωτόνια από άλλα μέρη φιλτράρονται. Η οπτική τεμαχισμό πραγματοποιείται μέσω του "χωρικού φίλτρου".
Επειδή μόνο ένα σημείο εμφανίζεται "ομοεστιακή" απεικόνιση σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, μια συσκευή σάρωσης απαιτείται για να μετακινήσετε το σημείο στο πεδίο αντικειμένων σε μια λειτουργία πλέγματος. Συνήθως, ο οπτικός καθρέφτης είναι εγκατεστημένος στον κινητήρα σάρωσης και χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της διαδικασίας σάρωσης. Υπάρχει μια συμφόρηση στο χρόνο που απαιτείται για να σαρώσετε ένα πλήρες πλαίσιο (συνήθως) 1.024 γραμμές. Οι βελτιώσεις έχουν επιτευχθεί με την εισαγωγή ενός σαρωτή υψηλής ταχύτητας (σαρωτή συντονισμού) που σαρώνει 8, 000 ή περισσότερες γραμμές ανά δευτερόλεπτο.
Μόνο κάτω από την τεχνολογία μικροσκοπίου του ανακλώμενου φωτός μπορεί να επιτευχθεί μια καλή οπτική φέτα. Αυτός είναι ένας από τους λόγους για την έντονη ανάπτυξη της μικροσκοπίας φθορισμού τα τελευταία 20 χρόνια (άλλοι λόγοι περιλαμβάνουν την εφεύρεση της ανοσοχρώσης, της υβριδοποίησης DNA, του φθορισμού βιοαισθητήρα, των κβαντικών κουκίδων και της φθορίζουσας πρωτεΐνης).
Εικόνα 4: Από αριστερά προς τα δεξιά: 1. Ο κώνος φωτισμού όχι μόνο διεγείρει τη φθορίζουσα βαφή στο εστιακό επίπεδο, αλλά και το ενθουσιάζει προς τα πάνω και προς τα κάτω. Εδώ αντιπροσωπεύεται από έναν πράσινο διπλό κώνο. 2. Η οπή εκπομπής παρακολουθεί αποτελεσματικά το φως που εκπέμπεται από πάνω από το εστιακό επίπεδο. 3. Επιπλέον, το φως από κάτω από το εστιακό επίπεδο δεν θα περάσει από την οπή. 4. Στο ομοεστιακό σύστημα, μόνο το φως από το δείγμα θα φτάσει στον ανιχνευτή. Η ανίχνευση οπών θα απορρίψει αποτελεσματικά οποιοδήποτε φως από άλλες περιοχές. Τέλος, λαμβάνεται η πραγματική οπτική ενότητα.
